摘要

液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)是一種準(zhǔn)確測定核酸的方法。本前研究的目的是利用ddPCR評價慢性髓系白血病(CML)患者的微小殘留病(MRD)?；颊呒胺椒ǎ?/span>2013年5月至2014年11月，采用尼洛替尼治療的CML患者被納入研究。在第一次*分子反應(yīng)(CMR)時使用ddPCR評估BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本水平。我們招募了來自7個機(jī)構(gòu)的15名患者。治療期為45個月和47個月。結(jié)果：高水平BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的患者在隨訪期間更容易失去CMR (p=0.095)。此外，BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平低的患者與高水平患者相比，CMR持續(xù)時間更長(p=0.032)。結(jié)論:ddPCR是一種靈敏的檢測MRD的方法，MRD可影響治療反應(yīng)持續(xù)時間。

慢性髓系白血病(CML)的細(xì)胞遺傳學(xué)特征是t(9;22)(q34;q11.2)，產(chǎn)生BCR/ABL1融合癌基因。自人類第一種靶向藥物伊馬替尼成功以來，更有效的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)，如達(dá)沙替尼和尼洛替尼被引入CML的一線治療，并顯示76~82%的主要分子應(yīng)答率。CML現(xiàn)在被認(rèn)為是一種終身疾病，5年總生存率>90%。以前的報道已經(jīng)證明，早期分子反應(yīng)的實現(xiàn)是改善預(yù)后的一個強(qiáng)有力的預(yù)測指標(biāo)。因此，歐洲白血病網(wǎng)指南建議的最佳響應(yīng)百分比BCR/ ABL1融合轉(zhuǎn)錄本在國際規(guī)模(BCR / ABL1) < 10%，初始治療后3個月，緊隨其后的是<1%，6個月和12個月，0.1%使用定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRTpcr)。此外，最近的證據(jù)表明，深度分子反應(yīng)(DMR)的成就，包括MR4 (BCR/ABL1 IS≤0.01%)或MR4.5 (BCR/ABL1IS≤0.0032%)，是良好生存和無治療緩解的替代標(biāo)志。選擇達(dá)到DMR的患者可以嘗試停用TKIs，以改善他們的生活質(zhì)量和緩解經(jīng)濟(jì)壓力。雖然qRT-PCR通常用于常規(guī)監(jiān)測，但需要額外的敏感方法來檢測微小殘留疾病(MRD)。摘要液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)可對核酸進(jìn)行精確定量。由于其陽性結(jié)果，它已被用于檢測血液病的MRD。在CML中，ddPCR已被驗證用于精確測量BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本。我們假設(shè)，與傳統(tǒng)的qRT-PCR相比，ddPCR在檢測DMR患者的癌轉(zhuǎn)錄本水平方面更敏感。因此，本研究的目的是利用ddPCR對尼洛替尼治療的CML患者進(jìn)行MRD評價，這些患者首先通過qRT- PCR獲得了*分子反應(yīng)(CMR)。我們還評估了ddPCR陽性與患者預(yù)后的關(guān)系。

患者及方法患者特點：

從2013年5月到2014年11月，我們前瞻性地納入了費城染色體(Ph)陽性CML慢性期患者，這些患者在尼洛替尼治療期間獲得了CMR。所有患者均采用尼洛替尼300 mg，每日2次作為一線靶向治療。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)與開放標(biāo)簽、多機(jī)構(gòu)4期ENESTKorea試驗相同。本研究包括被診斷為ph陽性慢性粒細(xì)胞白血病的成年患者。在入組前6個月內(nèi)，通過至少20個骨髓中期細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)分析證實了診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：i)非典型BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的CML(轉(zhuǎn)錄本不包括e13a2或e14a2，ii)既往使用骨髓抑制藥物治療(羥基脲和阿納格列德除外)，iii)既往使用TKI治療超過兩周，iv)既往造血干細(xì)胞移植，v)既往放療涉及25%或以上骨髓組織，vi)細(xì)胞病理證實CML中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，vii)東部合作腫瘤組表現(xiàn)狀態(tài)≥3 (12)，viii)心臟異常，包括：a)糾正心電圖QT間期≥480毫秒，b)*左束支傳導(dǎo)阻滯，c)forever性起搏器植入，d)先天性長QT綜合征，e)需要治療的快速心律失常病史，f)臨床上顯著的靜息性心動過緩，g) 12個月內(nèi)有急性冠脈綜合征病史，h)失代償性充血性心力衰竭，ix)器官功能障礙，定義為：a)血清總膽紅素水平≥1.5×正常范圍上限(ULN)，b)肌酐≥1.5×ULN，c)天冬氨酸或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2.5×ULN，d)淀粉酶或脂肪酶≥1.5×ULN，e)堿性磷酸酶≥2.5×ULN，與CML無直接關(guān)系，x) CML以外的活性和未受控制的惡性腫瘤，xi)高血壓或糖尿病未控制，xii)感染活躍且未控制，xiii)兩周內(nèi)接受大手術(shù)或前一次手術(shù)未*恢復(fù)，xiv)先天性或獲得性出血傾向，xv)胃腸吸收受損，xvi)小腸切除或搭橋手術(shù)史，xvii) 12個月內(nèi)有急性胰腺炎或慢性胰腺炎病史，xviii)同時服用強(qiáng)而不可替代的CYP3A4抑制劑或誘導(dǎo)性藥物、QT延長劑或XDS衍生物，xix)任何其他不受控制的醫(yī)療狀況，可能存在重大的安全風(fēng)險或危及研究治療的依從性。在入選ENESTKorea試驗的患者中，我們選擇了隨訪期間獲得CMR的患者，在他們F獲得CMR時，我們可以使用ddPCR評估BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本的水平。通過qRT-PCR將CMR定義為不可檢測的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平。隨訪期間，對所有患者進(jìn)行評估，每3個月在中心實驗室(韓國大田BML)進(jìn)行qRT -PCR，量化BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為BCR/ABL1 ^IS。本研究采用ENESTKorea試驗的qRT-PCR方案。本研究使用的qRT -PCR的靈敏度為MR ^4.5。通過各機(jī)構(gòu)的醫(yī)療記錄審查收集臨床信息，包括患者人口特征、BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本水平和不良反應(yīng)(AEs)。

BCR/ABL1融合轉(zhuǎn)錄本水平測定-定量RT- PCR分析mRNA水平。根據(jù)制造商的說明書，使用SuperScript®III first-strand Synthesis (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)將分離的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。最終反應(yīng)體積為20 μl，加入總RNA1 μg。反應(yīng)混合物在50?C孵育50分鐘，然后加熱至85?C5分鐘停止反應(yīng)，然后在-20?C保存至下一步。逆轉(zhuǎn)錄后，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的2 μl為模板，進(jìn)行BCR/ABL1和BCR擴(kuò)增。使用SsoAdvanced™UniversalSYBR®Green Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, USA)和CFX384Real- Time System thermocycler (伯樂)在總?cè)莘e為15 μL的條件下進(jìn)行PCR。放大曲線包括在95?C變性30s，1個循環(huán)，然后在95?C變性15s，然后在65?C退火和延伸30s，45個循環(huán)。PCR完成后，使用熔化曲線分析檢測BCR/ABL1和BCR的擴(kuò)增模式。以每個樣本的閾值循環(huán)數(shù)(C_T)確定拷貝數(shù)，并與每個重組質(zhì)粒(包括BCR或BCR/ABL1擴(kuò)增區(qū))的7個不同拷貝數(shù)(從10⁶到10⁰拷貝)生成的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。BCR/ABL1的引物為5' -GATGCTGACCAACTCGTGTG-3 '為正向引物，5 ' -AACGAAAAGGTTGGGGTCA T-3 '為反向引物。BCR的引物為5 ' -TTCTGGACCACCTGAAAAGG-3 '為正向引物，5 ' -GCTCTGTCTCTTGCTGTCC-3 '為反向引物。

微滴體系。ddPCR的總體積為20 μl，包含10μl EvaGreen supermix (2×，伯樂)，每個引物(最終濃度為150nM)，無DNase/ Rnase無菌水，以及不同體積稀釋的cDNA(40、20或5ng)實現(xiàn)更高的靈敏度并定義閾值。引物序列如下，BCR正向引物：5 ' -TTC TGG ACC ACC TGA AAA GG-3 '，BCR反向引物：5' -TGC TCT GTC TCT TGC TGT CC-3 '，BCR/ABL1正向引物：5 ' -GA T GCT GAC CAA CTC GTG TG-3'，BCR/ABL1反向引物：5 ' -AAC GAA AAG GTT GGG GTC A T-3'。將每個ddPCR混合物裝入DG8液滴產(chǎn)生器(伯樂)的每個樣品孔中，然后將70μl EvaGreen (伯樂)的液滴產(chǎn)生油裝入DG8液滴產(chǎn)生器的每個油槽中。加藥槽被放置在QX200液滴發(fā)生器(伯樂)中。當(dāng)液滴生成完成時，每口液滴槽中大約生成20,000個液滴。每個液滴孔中的液滴轉(zhuǎn)移到96孔PCR板(伯樂)上，使用PX1PCR板封口器(伯樂)在180℃下密封5s，然后進(jìn)行熱循環(huán)。PCR板置于C1000Touch擴(kuò)增儀(伯樂)中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)條件為：i)在95?C下5min，ii)在95?C下變性30s，40次循環(huán)，iii)在58?C下退火1min，iv)在4?C下5min，v)90?C下5min，vi) 4?C無限保持。所有PCR步驟均以2?C/s的變化進(jìn)行。無模板對照和陽性對照(由K562總RNA合成的cDNA)均包含在每項檢測中。

數(shù)字PCR。在熱循環(huán)之后，將包含液滴的PCR板加載到QX200液滴讀取器(伯樂)上，使用多像素光子計數(shù)器識別evgreen熒光團(tuán)的每個液滴的熒光強(qiáng)度。這種檢測器讀取液滴，通過逐滴繪制熒光圖來識別那些包含(+)或不包含(-)目標(biāo)基因的液滴。我們只對熒光水平與背景熒光水平有顯著差異的樣本確定液滴為陽性液滴。我們使用QuantaSoft 1.7.4版本軟件(伯樂)測定靶基因的濃度，以copies/ μl為單位。

統(tǒng)計分析。分類變量的比較使用Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法分析治療反應(yīng)期。CMR持續(xù)時間定義為qRT-PCR檢測不到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本(BCR/ABL1 ^IS =0%)的時間。MR ^4.5的持續(xù)時間定義為從F未檢測到BCR/ALB1(即ddPCR進(jìn)行當(dāng)天)到qRT-PCR檢測到MR ^4.5缺失(BCR/ABL1 IS =0.0032%)的時間。BCR/ALB1轉(zhuǎn)錄本水平的臨界值是使用40、20或5ng RNA測量的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本總水平的中位數(shù)(3.6拷貝/20μL)(表II)。研究議定書經(jīng)7家醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會審查和批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基生物醫(yī)學(xué)研究宣言》確立的原則。所有患者均知情同意納入本研究。

結(jié)果

患者特點。2013年5月至2014年11月，來自7家機(jī)構(gòu)的15例患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)(圖1和表I)。共有110例患者的中位隨訪時間為22.7個月(范圍為0.1~54.2個月)，80例患者的中位隨訪時間為未達(dá)到CMR，分別為22.5個月(范圍=0.1~37.0個月)。15例納入研究的患者中位隨訪時間為47個月(39~61個月)。所有患者均接受尼洛替尼開始劑量300mg，每日2次。中位患者年齡56歲(范圍=38~83歲)。男性10例(66.7%)，女性5例(33.3%)。

表Ⅰ.患者基線特征(n=15)

表Ⅱ.在IS0%時，ddPCR檢測BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平。

ddPCR：液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)，IS是：國際標(biāo)準(zhǔn)。

ddPCR檢測。我們測量了水平的BCR/ABL1和BCR記錄三次使用ddPCR CMR首先實現(xiàn)時，所驗證中存在的中間值(表2)。總BCR/ABL1和BCR轉(zhuǎn)錄水平3.6拷貝/20μl(范圍= 1.2 ~6.8拷貝/20μl)和15758拷貝/20μl(范圍=1802~34140循環(huán)/20μl)。

ddPCR結(jié)果和治療結(jié)果。15例患者的中位治療和隨訪時間分別為45個月(37~55個月)和47個月(39~61個月)。除了一個病人改用伊馬替尼由于尼洛替尼引起的心血管事件而開始使用尼洛替尼37個月后，14例患者繼續(xù)接受尼洛替尼治療。隨訪期間，所有患者均維持較大的分子反應(yīng)(BCR/ABL1^IS≤0.1%)。15例患者中，2例患者在隨訪期間失去CMR。1例患者持續(xù)CMR超過21.3個月后失去CMR, qRT-PCR檢測出0.002%的BCR/ABL1。另1例患者CMR丟失，維持20.5個月后BCR/ABL1檢測率為0.012%。然而，在最后的隨訪期間，他們沒有失去MMR(一個病人9個月，另一個病人在失去CMR后8個月)。在隨后的分析中，我們使用總BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平的中位數(shù)(3.6拷貝/20μl)作為臨界值。雖然高水平(>3.6拷貝/20μl)BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本的患者在隨訪期間有失去CMR的傾向，但低水平(0/10,0%)和高水平(2/5,40%)患者之間的CMR損失沒有顯著差異(p=0.095;表III)。通過ddPCR測量，低水平BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本患者的CMR持續(xù)時間延長(2年持續(xù)CMR率:低水平為100%，高水平為37.5%，p=0.032;圖2A)。然而，從第一次CMR的第一天到MR^4.5損失的第一天，兩組之間沒有顯著差異(2年持續(xù)MR^4.5的比率:低水平100%vs高水平75.0%，p= 0.186;圖2B)。

圖2，Kaplan Meier圖表。(A)*分子反應(yīng)持續(xù)時間取決于用ddPCR檢測BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平(中位數(shù)：3.6拷貝/20 μL)。(B) qRT-PCR未檢測BCR/ABL1到MR^4.5缺失的周期。IS是:國際規(guī)模,MR^4.5:4.5 log減少時的分子反應(yīng)，ddPCR：液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)，qRT-PCR：實時定量聚合酶鏈反應(yīng)。

表Ⅲ.隨訪期間CMR喪失的趨勢。

討論

MRD被認(rèn)為在各種癌癥中非常重要，因為治療后低或陰性MRD與較長的反應(yīng)持續(xù)時間和生存期相關(guān)，而DMR的成功預(yù)測了CML患者更好的臨床結(jié)果。由于戒斷臨床研究(即STIM和TWISTER研究)的顯著結(jié)果，適當(dāng)選擇陽性CMR患者對于預(yù)測無治療緩解的成功非常重要。目前，qRT-PCR是監(jiān)測TKI反應(yīng)和MRD以及預(yù)測早期復(fù)發(fā)的主要方法。qRT-PCR雖然相對敏感，但由于標(biāo)準(zhǔn)化程度低、勞動強(qiáng)度大，存在一些局限性。克服這些限制，最近新興技術(shù)，如下一代測序、下一代流和ddPCR，已經(jīng)應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療。其中，ddPCR是一種*的方法，其結(jié)果與qRT-PCR有很強(qiáng)的相關(guān)性。ddPCR可以在不需要參考標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下測量絕對拷貝數(shù)。此外，它可以檢測靈敏度超過10^-6的核酸，受抑制物質(zhì)、非靶RNA和非特異性擴(kuò)增的影響較小。由于這些優(yōu)點，ddPCR在癌癥研究中已被用于評估循環(huán)腫瘤DNA、突變和腫瘤負(fù)擔(dān)。ddPCR也被用于檢測血液系統(tǒng)惡性腫瘤的MRD和預(yù)測預(yù)后。因此，ddPCR可能是qRT-PCR的最佳替代方式，然而，ddPCR的缺點，包括它的高成本，時間密集，和有限的數(shù)據(jù)在臨床設(shè)置，必須解決，以使其更廣泛的應(yīng)用。

我們的結(jié)果表明，ddPCR可以作為qRT-PCR的補(bǔ)充，作為檢測MRD的一個敏感工具。盡管qRT-PCR證實CMR狀態(tài)(BCR/ABL1^IS =0%)，但所有患者均通過ddPCR檢測到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本。此外，我們注意到CMR的持續(xù)時間因MRD的不同而有顯著差異，這與F實現(xiàn)CMR時的ddPCR檢測結(jié)果一致。這一發(fā)現(xiàn)表明，低MRD是維持較長緩解期的重要因素，與以前的研究結(jié)果一致。然而，由于我們所有的患者在使用TKIs治療期間都維持了主要的分子反應(yīng)，因此，ddPCR檢測到的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平升高是否作為治療失敗的臨床意義尚存疑問。此外，由于尼洛替尼的治療反應(yīng)較好，大約80%的細(xì)胞遺傳學(xué)*緩解率，所有患者在隨訪期間可能保持最佳緩解。因此，為了評估長期結(jié)果，可能需要進(jìn)一步的隨訪。本研究的另一個局限性是我們不能常規(guī)使用ddPCR每3個月進(jìn)行反應(yīng)監(jiān)測。由于ddPCR尚未廣泛商業(yè)化，ddPCR的頻繁使用受到限制。另外，一些患者根據(jù)輸入RNA的結(jié)果不均勻，這也是另一個限制。利用ddPCR定量檢測BCR/ABL1的標(biāo)準(zhǔn)尚未確立。因此，有一個協(xié)調(diào)一致的努力，以獲得精確的結(jié)果與更少的假陽性液滴(例如，使用足夠的cDNA體積)。然而，先前的一項研究表明，即使使用健康的捐贈者，假陽性率也可以達(dá)到2%。因此，為了提高ddPCR的敏感性，需要進(jìn)一步規(guī)范和驗證方案。

我們研究的另一個局限性是，盡管這是一個多機(jī)構(gòu)的研究，但樣本量小。因此，需要一項大規(guī)模的研究來證實這些結(jié)果。盡管有這些局限性，但據(jù)我們所知，這是第一個報道CMR狀態(tài)的CML患者中，根據(jù)ddPCR測量的BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果存在差異的研究?？傊?，我們證明了在CML患者中使用ddPCR檢測無法檢測到BCR/ABL1轉(zhuǎn)錄本時的MRD的敏感性，正如qRT-PCR所測量的那樣。此外，CMR持續(xù)時間因MRD的不同而有顯著差異。要將ddPCR廣泛應(yīng)用于監(jiān)測治療反應(yīng)和MRD檢測，還需要進(jìn)一步的大規(guī)模試驗和嚴(yán)格驗證。

結(jié)論